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1.药用真菌的分离培养与菌种保藏是什么？

药用真菌的分离培养与菌种保藏是什么？

（冉砚珠）

一、纯菌种的分离培养

为了得到某种药用真菌的纯菌种，必须将它从其周围的其他生物或微生物中分离出来。分离工作要根据药用真菌的特性，从分离方法、培养基的种类、培养条件的控制以及在培养基中是否添加某种抑制剂等等综合考虑，否则达不到分离菌种的有效目的。纯菌种的分离方法大致有三种：组织分离、孢子分离及寄主分离。

（一）组织分离法

利用幼嫩组织中的菌丝，在无菌条件下，接种在培养基上，重新恢复为没有组织分化的菌丝体，这种方法分离得到的菌种生命力强，菌丝生长快，得到纯菌的生活率较高。此法适应范围较广，特别是对有些孢子不易萌发或萌发速度不一致的种类以及菌核、菌索等组织，采用此法为宜。

进行组织分离，事先要对分离材料进行选择，要求材料必须是品系纯正，品质优良，幼嫩肥壮而无病虫害，然后进行表面消毒处理。先用清水洗净外面沾附的泥土或杂物，放入无菌操作室（柜）中的无菌器皿内，用表面消毒剂（如0.1—0.2%升汞、10%漂白粉、70—75%酒精、5%来苏儿或2%甲醛等）溶液浸泡一定时间。消毒时间要根据消毒剂的特性和菌体组织的质地、大小而定。一般如菇类（香菇、蜜环菌）鲜嫩的组织，消毒时间要短，控制在0.5—1.0分钟，这样既不会伤害组织又能达到组织表面杀菌的目的；像表皮组织比较厚的猪苓菌核，在5%的来苏儿溶液中泡半小时以上，不致影响生活力。升汞溶液杀菌力较强，组织经表面消毒后，必须再经无菌水冲洗，去掉附着的残留药物，以免影响菌体萌发生长。无菌水冲洗后要用灭菌滤纸吸去沾附的水分，用无菌刀将组织切割成约0.5cm2小块，分别放置在预先灭过菌而装有培养基的培养皿或试管中，一般每皿5块左右，排开保持一定间隔，试管内仅放1块为宜。培养时将皿底朝上，置24—28℃恒温下培养数天，组织块周围就可长出新的菌丝，再经纯化即可得到纯菌种。

表面消毒时，如方法掌握不当或无菌操作不严格，往往会造成污染，消毒过度则菌体本身生活力丧失而分离不出纯菌种，分离多孔菌类或菌肉较肥厚的伞菌类真菌，也可不用药剂浸泡，只要用70—75%酒精棉涂擦外皮后，去掉表皮，挑取内部组织块直接进行分离。为了防止细菌感染，可将要分离的组织小块用0.1—0.5%金霉素（或链霉素）浸蘸一下再移置。为防止培养基上污染细菌可在每毫升培养基内加入0.125mg氯霉素，因它较前两种稳定、耐高温，可与培养基一同高压灭菌。

分离药用真菌时，通常使用的培养基成分如下：

马铃薯（去皮） 200g（切碎煮沸半小时过滤去渣）

蔗糖 20g

磷酸二氢钾 3g

硫酸镁 1.5g

维生素B1 10mg

琼脂 18g（加水至1000ml）

除上述培养基外，也常用沙氏培养基或马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基。

（二）孢子分离法

这是利用药用真菌的菌褶或菌孔中着生的孢子，使其在无菌条件下弹射在适合生长的培养基上，并萌发生长成菌丝而得到纯菌种的一种方法。这种方法在香菇、银耳、茯苓等药用真菌中分离应用。

药用真菌的有性孢子，都是由异性的细胞核，经核配后形成的，具双亲的遗传性，变异性大，生命力强，适于育种工作采用，为防止杂菌感染，分离材料要严格消毒，对于子实层未外露的子实体，可浸入0.1—0.2%升汞溶液中2—3分钟进行表面消毒。子实层外露的如香菇，为避免孢子杀伤，需用70—75%酒精对菌盖、菌柄进行表面消毒，把子实体切去菌柄，插在金属丝制成的支架上，一并放入培养皿中，外面套以玻璃缸或钟形罩，经数小时后在培养皿内就可以收集到大量的孢子。此外也可以采取悬挂法。如银耳，将耳瓣用清水洗净后，放入无菌三角瓶或大试管内，以无菌水振荡冲洗三次，取出放于无菌玻皿内，用滤纸吸去多余水分，剪一片耳瓣在灭过菌的细铁丝钩上，然后悬挂在倒有一薄层培养基的三角瓶中，耳瓣距基面2—3cm。在24—26℃下，经1—2天培养，就可在基面上隐约可见到白色孢子。再继续培养2—3天就可以形成乳白色糊状突起菌落。即银耳芽孢菌种。由于这样得到的菌种在木屑上菌丝不能萌发，故不能直接作为瓶栽的菌种。

茯苓菌担孢子分离是在其子实体发射孢子云时采用。用空中捕捉法，以试管口对准孢子云，使孢子落入试管培养基上。或用附着法，即使上升的孢子云附着在培养基上面，在25℃下培养。

如果以杂交育种为目的，要采用单孢子分离法。利用单孢子分离器进行单孢子分离，是目前先进手段，但设备昂贵，国内只有少数单位使用。较为广泛应用的是菌液连续稀释法。其方法是用无菌水把孢子冲散，最大限度地降低孢子在无菌水中的分布密度，最后使每滴水中只含1—2个孢子。然后用无菌注射器吸入孢子悬浮液，滴在斜面基表面，转动试管，菌液便均匀分布在斜面上，经适温培养，选优良菌落进行纯化。异宗结合担子菌的单孢子分离物，虽然可繁殖菌丝，但不会形成子实体，故不能用于栽培生产。

（三）寄主分离法

此法也称基内菌丝分离法。这是利用生长某种药用真菌菌丝的基质做分离材料而获得纯菌种的一种方法。一般只有在上述两种方法不能达到目的的情况下应用。被选做种子的子实体，若孢子已释放完毕，子实体开始干枯或腐烂，菌丝失去活性，难以用孢子分离及组织分离法得到纯菌种，或某些品种子实体的质地为胶质（银耳、木耳）、革质（云芝）、木栓质（灵芝）、木质（针裂蹄）等类群均可采用此法。

选择菌木的标准：生长的子实体性状优良，基内菌丝发育旺盛，菌木未腐烂无杂菌污染。为防止细菌污染，除使用酸化培养基或加入抗菌素外，应使菌木风干失水。如耳木、菇木及苓木。以银耳为例，选好耳木后，在子实体生长的部位，削下1—1.5cm厚的菌木一片，去掉树皮，把菌木片放入0.1%升汞液中浸泡几分钟表面消毒，冲去药液，吸干表面水分，放入无菌室（柜）的培养皿内，切去木片外层，将中间生长菌丝的部分，用无菌刀切成0.5cm2大小小块，放入培养基表面进行适温下培养和纯化移植。

由于药用真菌种类不同，所形成的菌落外观及结构也各有差异。因此鉴定所分离的菌种，除根据经验外，更确切的是经过一段培养，待形成一些特殊结构，如菌丝束、菌核、菌索，尤其是子实体和孢子后方可判断。

二、菌种的保藏与复壮

药用真菌菌种是国家的重要资源与天然财富。也是药用真菌生产与科研的基础。药用真菌的“种”不同，其药用价值及培养条件也不同，就是同一“种”的不同菌株，也同样有差异。在生产实践中要选用符合生产要求的菌种，应具备药效好，生产周期短、产量高、生活力强等特点。对有效成分明确的，应选用含量高的菌株，对有效成分未确定的，应选药理作用显著，无毒性反应及临床疗效好，产量高的菌种。生产上也可以根据一定的目的要求，应用菌体的自然变异加以选择，不断巩固其特性育成新菌株或人为的定向培育改良菌种特性。如通过杂交或诱变育种选择优良菌株，使生产或有效物质含量达到新的水平。

一个品系纯正、品质优良的菌种，常由于管理不善和传代过多以及贮藏方法不当等原因，而引起优良性状的退化，这种现象称为菌种退化。为防止菌种性状的退化或恢复已经发生退化的菌种原有性状，应采取科学的保藏方法与有效的复壮措施。

（一）菌种的保藏方法

药用真菌菌种在干燥低温、冷冻或减少氧气含量等条件下保藏，使其代谢强度降低，维持菌种的休眠状态，就可防止菌种退化。

1.斜面低温保藏

除草菇等个别属高温型菌种，适于在15℃左右条件下保藏外，绝大多数种类都适合于低温保藏。即把保存的菌种放于4—5℃左右冰箱中，经3—6个月转管传代一次。为恢复菌种的生活能力，需在使用前1—2天从冰箱中取出，置于常温下进行活化转管，不能直接使用。

2.矿物油封藏法

将上述斜面菌种，灌注一层灭菌的液体石蜡油，在三角烧瓶中灭菌时由于有蒸汽进入，会影响所保存菌种的质量，因此需要放在40℃温箱中使水蒸气蒸发后再使用。冷石蜡油用无菌吸管注入，注入量要足够覆盖整个斜面并高出培养物1cm，试管口棉塞用玻璃纸或塑料布包紧，放置冰箱或室温保存。这种保存方法可以防止培养基失水及外界空气进入，可降低新陈代谢，保持菌种活力，从而起到延长菌种使用寿命的效果。从石蜡管中挑取菌丝移置到新斜面上活化培养，以后可供生产用。此法可保存菌种1—2年不丧失活力。

3.冷冻干燥法

此法是采用真空、干燥和低温三结合保藏菌种的方法，保存期可长达10—20年。具体方法：将保存真菌的孢子制成悬浮液，装入安瓶管中，然后骤然降温冷冻，并抽出空气成真空状态，使培养物以固体状态升华脱水，熔封瓶口后，在低温或室温下保存。

4.液氮超低温保藏法

超低温能使代谢机能降低到最低水平而菌种不发生变异。实验证明，采用这种新技术可以保藏所有的微生物菌种。液氮超低温冰箱内的温度可达-196—-130℃。超低温保藏菌种具高效、使用范围广、操作简便等优点，但仪器价格昂贵，应用尚不普遍。

除上述几种保藏菌种方法外，还发现灵芝菌（赤芝、薄盖灵芝）在麦麸及小米斜面上，于低温（4℃左右）保存一年多仍具有生命力。若保存管的棉塞换以橡皮塞则可保存达4年以上。

（二）菌种复壮

药用真菌的种类繁多，生物特性各异，任何一个选育出来的优良品种，都常因多次传代培养，长期进行人工培养或长期保藏而不进行转管以及保藏条件不适等，菌种就会发生自然变异，出现退化现象。

菌种退化的主要表现有，菌丝体生长缓慢，子实体性状变坏，产量下降以及有效成分降低等。过多次传代，会由于菌丝长期处在活跃的营养生长状况，生命繁衍受到抑制，因此传代次数应控制在2—3次之间。已经产生退化的菌种，有必要继续保留和应用时，则必须进行菌种复壮。进行菌种复壮时，除应改善培养条件外，对已驯化的栽培种类，最可靠的方法就是进行有性繁殖（孢子分离）。

银耳菌丝菌种，经多次传代后会出现生活力弱，出耳率低的退化现象。可利用加入芽孢的方法复壮菌种。即取芽孢试管1支注入10ml无菌水，将芽孢悬液接入锯木屑菌种中，这样菌种出耳率会得到提高。芽孢菌种在木屑基中不能萌发菌丝，如加上1—2%过磷酸钙和1—2%骨粉则可萌发菌丝。用重新接种原寄主的方法也可起复壮作用。